American Diabetes Association

K_ATP通道缺失导致β细胞Ca²⁺敏感性及Trpm5表达下调影响胰岛素分泌

研究背景与概述

ATP敏感的钾离子通道（K_ATP通道）是胰岛β细胞中调控胰岛素分泌的关键分子。该通道由Kir6.2和SUR1两个亚基组成，对细胞代谢状态高度敏感。在生理状态下，血糖升高会导致β细胞内ATP/ADP比值上升，抑制K_ATP通道活性，引起细胞膜去极化，继而激活电压依赖性钙通道，促进钙离子内流和胰岛素分泌。

K_ATP通道的功能丧失性突变（Loss of function，LOF）会导致通道持续关闭，使β细胞处于慢性去极化状态，引起胰岛素分泌亢进，最终导致先天性高胰岛素血症（Congenital Hyperinsulinism，CHI）。然而，临床观察发现一个令人困惑的现象：许多CHI患者在疾病后期会出现胰岛素分泌不足，甚至发展为糖尿病。这种从胰岛素分泌亢进到分泌不足的“转变”现象同样在K_ATP通道基因（Sur1或Kir6.2）敲除（KO）动物最终会出现胰岛素分泌不足甚至发展为糖尿病。这种现象表明K_ATP通道的慢性功能缺失可能通过某种机制影响β细胞的功能和胰岛素分泌能力。

为了阐明这一现象背后的分子机制，研究者利用Sur1基因敲除小鼠和缓释格列本脲（Glib）处理的野生型小鼠作为研究模型，系统研究了K_ATP通道缺失对β细胞功能的影响。通过细胞内Ca²⁺浓度测定、胰岛素分泌测定以及转录组分析等多种研究手段，揭示了K_ATP通道缺失导致胰岛素分泌障碍的关键机制，为相关疾病的治疗提供了新的思路。

主要研究发现

1．K_ATP通道缺失降低胰岛素分泌对[Ca²⁺]_i的敏感性

研究发现，与野生型（WT）小鼠相比，Sur1 KO小鼠表现出显著的葡萄糖耐受不良（图1A），但胰岛素敏感性正常（图1B）。据预测，K_ATP的丢失会引起慢性β细胞去极化，增加[Ca²⁺]_i并刺激胰岛素分泌葡萄糖。然而，在低糖状态下Sur1 KO胰岛的胰岛素分泌没有升高，并且在刺激葡萄糖状态下仍显著低于WT胰岛（图1C）。虽然Sur1 KO胰岛的胰岛素含量低于WT小鼠（图1D），但这种差异不足以解释其葡萄糖依赖性分泌的显著降低（图1E）。

图1 K_ATP缺失导致葡萄糖依赖性胰岛素分泌减少，Ca²⁺依赖性胰岛素分泌增加

(A) WT和Sur1 KO小鼠的葡萄糖耐量试验；(B) WT和Sur1 KO小鼠的胰岛素耐量试验；(C) WT和Sur1 KO胰岛在不同浓度葡萄糖或30 mM KCl孵育1小时后的胰岛素分泌试验（GSIS）；(D) WT和Sur1 KO用于GSIS的总胰岛素含量；(E) GSIS相对于总胰岛素含量。

正如K_ATP丢失所预测的那样，与WT胰岛相比，Sur1 KO胰岛的[Ca²⁺]_i在不同葡萄糖中都表现更高（图2A，B）。因此，尽管[Ca²⁺]_i等于或高于WT胰岛，Sur1 KO胰岛的葡萄糖依赖性胰岛素分泌仍然减少。在20mM葡萄糖和30 mM KCl中孵育诱导两种基因型的[Ca²⁺]_i进一步增加（图2C），这意味着无论是WT还是Sur1 KO，在4.8 mM KCl和20mM葡萄糖中都没有最大程度去极化，也没有达到饱和[Ca²⁺]_i。

图2 Sur1 KO胰岛[Ca²⁺]依赖性右移导致胰岛素分泌减少

(A) 体外胰岛负载Calbryte 590AM钙染料；(B) 评估从1-20 mM增加葡萄糖浓度时[Ca²⁺]_i的反应，使用共享希尔系数的四参数逻辑回归进行拟合；(C)在20 mM葡萄糖中使用30 mM KCl处理导致WT和Sur1 KO胰岛内[Ca²⁺]_i显著增加。

2．提高细胞外[Ca²⁺]可恢复胰岛素分泌功能

为了更全面地确定胰岛素分泌对[Ca²⁺]_i的依赖性，作者将细胞外[Ca²⁺]增加到超生理15 mM水平。在基础状态和高葡萄糖水平时，WT和Sur1 KO胰岛的[Ca²⁺]_i均增加（图2D），并且在高糖+KCl中达到相似的最大值。在所有刺激条件下，WT和KO胰岛的胰岛素分泌均增加（图2E），但在最大刺激的条件下（高糖+KCl），WT和Sur1 KO胰岛的分泌也达到了相似的最大水平（图2F），这表明在正常细胞外[Ca²⁺]条件下，Sur1 KO胰岛的低分泌主要反映了胰岛素分泌的[Ca²⁺]_i依赖性的右移，而不是胰岛素含量或内在分泌胰岛素的能力的丧失。

图2 Sur1 KO胰岛[Ca²⁺]依赖性右移导致胰岛素分泌减少

(D) 在WT和Sur1 KO胰岛中，细胞外Ca²⁺从2.5 mM增加到15 mM导致葡萄糖依赖性[Ca²⁺]_i显著增加；(E) 在15 mM细胞外Ca²⁺中，测量WT和Sur1 KO的胰岛素分泌作为葡萄糖和KCl的函数；(F) 结合图1、图2和图3的数据，显示暴露在类似条件下胰岛的[Ca2+]i与分泌的胰岛素。

3．K_ATP通道缺失引起Trpm5表达下调

[Ca²⁺]_i依赖性的改变可能是由于胞吐机制或下游元素对钙敏感性的改变，或可能是由于细胞内钙浓度的改变，从而使Ca²⁺_i基本上处于“错误的位置”。既往研究表明，Sur1 KO小鼠的基因表达发生了明显的变化，这可能与此有关。植入缓释Glib颗粒的WT小鼠中，在数天内再次出现了与GSIS减少和葡萄糖耐受不良基本相同的转变（图3A），从而避免了K_ATP KO的潜在远期并发症。作者发现，在Glib植入10天的动物中，整个胰岛RNAseq和差异表达分析（图3B，在线补充材料表1）表明，Trpm5，一种与增强胰岛素分泌有关的非选择性Ca²⁺激活阳离子通道，是下调最显著的基因之一，这与Sur1 KO β细胞一致。通过单细胞RNAseq，作者鉴定了多个不同的细胞群（图3C，D），发现其中只有β细胞表现出与对照组显著的基因表达差异（图3E），并且再次显示Trpm5是下调最显著的基因（图3F，在线补充材料表2），通过qRT-PCR在Sur1 KO胰岛中也得到证实（图3G）。

图3 “转变”后整个胰岛基因表达的变化

(A) 与Sur1 KO小鼠相似，使用缓释Glib颗粒治疗10天的小鼠会导致糖耐量受损，这表明K_ATP缺失可迅速导致胰岛素分泌受损；(B) Glib处理后整个胰岛RNAseq显示差异表达基因；(C) 对胰岛进行单细胞RNAseq分析的UMAP图，揭示了不同的细胞群；(D) 来自图C的UMAP图中细胞类型的起源，揭示了β细胞群体中特异性的基因表达变化；(E) 对照组和Glib处理组小鼠所有细胞的Trpm5表达图；(F) β细胞群体基因差异表达显示Trpm5是下调最显著基因；(G) 实时定量PCR显示，Sur1 KO胰岛中Trpm5表达显著降低。

作者使用Trpm5 KO小鼠，并通过杂交单基因敲除产生Trpm5/Sur1双KO小鼠。发现Trpm5 KO小鼠的空腹血糖水平相对于WT小鼠有升高的趋势，但不显著（图4A）；而Trpm5/Sur1双KO小鼠的空腹血糖水平显著升高（图4B）。虽然先前研究报道了Trpm5 KO小鼠的葡萄糖耐量显著降低，但在作者的本次实验中没有观察到明显的降低（图4C，D）。Glib颗粒植入仍然会导致Trpm5 KO动物的糖耐量受损（图4C，D），尽管与WT相比，Trpm5 KO动物的糖耐量只有轻微的、不显著的减少（图4E，F），但这也表明Trpm5的缺失可能是转变中WT反应的次要因素。

图4 “转变”在Trpm5 KO中仍然存在

(A) WT和Trpm5 KO小鼠的空腹血糖水平；(B) Sur1 KO和Sur1/Trpm5双KO小鼠的空腹血糖水平；(C) WT和Trpm5 KO小鼠Glib颗粒植入前及植入后10天的葡萄糖耐量试验；(D) 图C葡萄糖耐量试验的AUC；(E) Glib治疗前后AUC的差异；(F) 图C葡萄糖耐量试验中每个时间点的血糖变化的曲线图。

研究意义

本研究首次阐明了K_ATP通道缺失导致胰岛素分泌障碍的分子机制，发现钙敏感性改变和Trpm5表达下调是关键因素。这一发现为理解和治疗相关代谢疾病提供了新的视角和潜在靶点。

（编译/冯安妮  肖玉波  审核/莫中成）